Publikacje:
Celem badań jest ocena wpływu angiotensyny drugiej (AngII) (poprzez receptor typu pierwszego (AT1-R)) na ekspresję receptora androgenowego (AR), kaweoliny pierwszej (CAV-1), naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) oraz ezryny (EZR) w nowotworach endometrium. Przypuszczamy, że angiotensyna druga jest czynnikiem stymulującym potencjał inwazyjny komórek nowotworowych endometrium we wczesnych etapach kancerogenezy oraz, że w tym procesie uczestniczy receptor androgenowy. Podstawą do podjęcia powyższych badań są wyniki, jakie otrzymaliśmy podczas analizy zmienności ekspresji AT1-R w tkankach nowotworowych endometrium o różnej charakterystyce kliniczno-histopatologicznej. Badania nasze wykazały, że występuje istotna korelacja pomiędzy ekspresją receptora AT1-R a wczesnym stadium zaawansowania klinicznego gruczolakoraka endometrium. Pokazaliśmy również, że w początkowym etapie rozwoju choroby istnieje odwrotna zależność pomiędzy ekspresją receptora AT1-R a VEGF. Wyniki te sugerują, że angiotensyna druga ma istotne znaczenie we wczesnych etapach transformacji nowotworowej komórek endometrium. Jednak, w przypadku nowotworów endometrium, nadal niewiele wiadomo o roli AngII, jako modulatora proliferacji i inwazyjności komórkowej. Androgeny są zaangażowane w wiele procesów regulacyjnych w nabłonku trzonu macicy, ale ich rola w rozwoju raka endometrium nie jest w pełni poznana. Ostatnio wykazano, że bardzo ważną rolę w rozwoju i progresji raka endometrium odgrywa lokalna synteza i metabolizm hormonów steroidowych. Wiemy również, że w przypadku tkanki nowotworowej obserwowana jest znacząco wyższa ekspresja receptora androgenowego niż w tkance prawidłowej. Wydaje się, więc istotne poznanie interakcji receptora androgenowego z innymi lokalnymi czynnikami wzrostu takimi jak np. AngII. Taką bezpośrednią zależność pomiędzy ekspresją receptora AT1-R a AR opisano w nowotworach męskiego układu rozrodczego – w nowotworach prostaty. W oparciu o nasze dotychczasowe obserwacje, w dalszych badaniach sprawdzimy czy występuje bezpośrednie powiązanie pomiędzy ekspresją receptora AT1-R a AR oraz czy zmiana ekspresji AR powoduje zmiany w ekspresji białek istotnych dla inwazyjności komórek (CAV-1 oraz EZR) oraz ich proliferacji (VEGF). Z uwagi na to, iż zwiększenie poziomu migracji komórek jest istotnym krokiem w rozwoju nowotworu, wytypowaliśmy do badań dwa białka uczestniczące w regulacji ruchliwości komórek. Ze względu na to, iż białka te są powiązane funkcjonalnie z receptorem androgenowym, przypuszczamy, że ich ekspresja może być pośrednio modulowana przez angiotensynę II. Pierwszym wytypowanym białkiem jest CAV-1. Białko to uważane jest za cząsteczkę regulatorową receptora androgenowego. Drugim białkiem jest ezryna, najnowsze badania sugerują, że w niektórych typach nowotworów (np.: kostniakomięsaku, raku jajników, czerniaku, raku piersi) może ona być istotnym czynnikiem wpływającym na zwiększoną ruchliwość komórek, a tym samym zwiększać ich potencjał przerzutowy. Także w przypadku ezryny wykazano istotne powiązanie z androgenami. Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu jest jednym z najlepiej poznanych czynników naczyniotwórczych niezbędnych w życiu pre- i postnatalnym. Powstanie unaczynienia jest warunkiem niezbędnym do wzrostu nowotworu i powstawania przerzutów nowotworowych. Podwyższone stężenie VEGF oznaczanego w osoczu u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca jest związane z obecnością przerzutów odległych. Również w przypadku nowotworów endometrium zaobserwowano korelacje pomiędzy poziomem VEGF w surowicy a możliwością wystąpienia metastazy. Nasze badania wskazują również, że czynnik ten może pełnić dominująca rolę w późniejszych etapach transformacji nowotworowej obejmującej endometrium, dlatego planujemy sprawdzić czy występuje korelacja pomiędzy jego poziomem a ekspresją AR, CAV- 1, EZR. Badania uwzględnią dualistyczny model in vitro nowotworów endometrium, dlatego wytypowane zostały następujące linie komórkowe: odpowiednikiem nowotworów typu I – o dobrze zróżnicowanych komórkach, pochodzących od kobiet z okresu przed-menopauzalnego, są komórki linii Ishikawa. Typ II – komórki średnio i nisko zróżnicowane pochodzące od kobiet w wieku pomenopauzalnym, są to linie komórkowe MFE-296, MFE-280. W pierwszym etapie badań planujemy sprawdzić, czy stymulacja komórek nowotworowych endometrium przez AngII wpłynie na ich proliferację, inwazyjność oraz czy będzie się wiązała ze zmianą ekspresji genów: AR, CAV- 1, EZR, MMP’s, jak również innych genów związanych min. metastazą, macierzą zewnątrzkomórkową i cząsteczkami adhezyjnymi. W drugim etapie badań planowane jest wyciszenie receptora AT1-R (z wykorzystaniem siRNA) i ponowne poddanie komórek działaniu AngII. W doświadczeniach zastosowane zostaną trzy stężenia AngII (0,1 μg/ml, 1,0 μg/ml oraz 10,0 μg/ml) w czterech przedziałach czasowych (24, 36, 48, 72 godziny –punkty pomiarowe będą dostosowane do czasu podwojenia liczby komórek każdej z badanych linii komórkowej). Proliferacja komórek oceniana będzie z wykorzystaniem testów WST-1, Alamar-blue i BrdU. Do identyfikacji i różnicowania komórek apoptotycznych od nekrotycznych wykorzystany zostanie zestaw Tali™ apoptosis. Ocena zmian inwazyjności wykonywana będzie w komorze Boydena, metodą wound-healing oraz zymografią. Do analizy zmian na poziomie genomu, wykorzystana zostanie metoda Real-time RT-PCR. Zmiany na poziomie białka analizowane będą metodą Western-Blot. Wpływ rezultatów Nasze badania przeprowadzone na modelu in vitro mogą przede wszystkim wyjaśnić molekularne podłoże zmian obserwowanych u pacjentek z rakiem endometrium oraz doprowadzić do wyodrębnienia kolejnego czynnika warunkującego indukcję i progresję nowotworzenia obejmującego tą tkankę. Będą one stanowić podstawę do kolejnych eksperymentów mających na celu sprawdzenie zaangażowania angiotensyny w proces kancerogenezy w błonie śluzowej macicy.